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细胞培养
发布时间:08月31日 浏览:3184   [ ] 视力保护色:

常规传代细胞培养


细胞复苏

从液氮储存罐中取出一支冻存的细胞种子,迅速放入36~40℃水中,快速解冻细胞,待细胞中完全解冻后用离心机1500rpm/min离心5min,超净工作台中弃去冻存管中的上清液,加入1ml 细胞生长液轻轻吹打混匀,转入底面积为35cm?的细胞培养瓶,补加 8ml 的细胞生长液,前后左右混匀后于含5% CO237℃恒温细胞培养箱培养8-10h,贴壁率达70%以上时换液,恒温培养箱继续培养至单层。

 

细胞传代培养

复苏的细胞长至致密单层时,在细胞间超净工作台中进行传代。

①   弃去细胞瓶中培养液,并用 1×PBS 洗两次,每次 5ml(动作温和,防止细胞脱落);

②   加入 1ml 细胞消化液,完全浸润细胞表面 15s,弃瓶中消化液,倒置,放入 37℃恒 温细胞培养箱中 10min

③   细胞完全消化后(细胞面疏松,轻拍细胞瓶,细胞完全脱落即完全消化),加入 5ml 细胞生长液,用 10ml 的移液管反复吹吸(动作温和,防止损伤细胞)制成单细胞悬液;

④   补加14ml 细胞生长液,混匀后分装至两个底面积35cm?的细胞培养瓶中,于含5% CO2 37℃恒温细胞培养箱培养,其中一瓶用于接种CVB5 病毒,另一瓶细胞实验备用。

 

细胞冻存

细胞贴壁率达到 80%-90%时,弃去细胞培养液,用 1×PBS 轻洗两次,弃去 PBS,按上述细胞传代中消化细胞的方法进行消化,待细胞消化完全时加入细胞冻存液来终止消化,轻轻吹打混匀,调整细胞浓度为 5×106 /ml,分装至细胞冻存管,体积为 1ml/管,密封。按以下顺序 4℃,1h-20℃,1.5h-40℃,1h-80℃,过夜;第二天将其放入液氮罐中,完全浸没于液氮,长期冻存备用。

 

各种原代细胞培养

①     取组织,放入平皿中。用PBS液洗组织23次。

②     剪碎胚体,用PBS液振荡洗涤,静置片刻,待胚块沉淀后吸去上清,重复3次。 

③     加胰酶(终浓度0.625%),置37℃消化至胚块“起毛”(大组织块边缘似纤毛运动)。

④     加入含小牛血清的培养基终止消化,用滴管反复吹打至见不到组织块。 

⑤     200目细胞筛过滤至离心管中,离心10 min

⑥     弃上清,加入少量生长液吹散细胞沉淀,加适量生长液,分装入细胞培养瓶,置37℃恒温培养箱培养。

 

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